An “ex vivo model” contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis
Un “modello ex vivo” per contribuire alla diagnosi ed alla valutazione di nuovi farmaci per la fibrosi cistica
A.M. Di Lullo1 2 3, M. Scorza2 3, F. Amato2 3, M. Comegna2 3, V. Raia4, L. Maiuri5, G. Ilardi6, E. Cantone1, G. Castaldo2 3, M. Iengo1
1 Department of Neuroscience, Section of Otorhinolaryngology, University of Naples “Federico II”, Italy; 2 CEINGE-Advanced Biotechnologies scarl, Naples, Italy; 3 Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnologies, University of Naples “Federico II”, Italy; 4 Department of Translational Medical Sciences, University of Naples “Federico II”, Italy; 5 Department of Science and Technology Innovation, University of Piemonte Orientale, Novara, Italy; 6 European Institute for Research in Cystic Fibrosis, San Raffaele Hospital, Milan, Italy
Summary
Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease caused by mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) gene. About 2000 mutations have been described so far. We setup an ex vivo model of human nasal epithelial cells (HNECs) to study CF patients testing the effect of novel mutations and molecular therapies. We performed sampling (by brushing), followed by culture and analysis of HNECs using a series of molecular techniques. We performed 50 brushings from CF patients and controls. Using cultured cells, we: i) demonstrated the widely heterogeneous CFTR expression in patients and in controls; ii) defined the splicing effect of a CFTR mutation; iii) assessed the CFTR gating activity in patients bearing different mutations; iv) demonstrated that butyrate significantly enhances CFTR expression. Based on our data, we can conclude: 1) HNEC brushing is performed without anaesthesia and is well tolerated in all CF patients (children and adults); 2) HNECs can be preserved for up to 48 hours before culture allowings multicentre studies; 3) HNECs culture can be considered a suitable model to study the molecular effects of new CFTR gene mutations and/or uncertain meaning specific mutations of carriers; 4) an ex vivo model of HNECs may be used to evaluate, before human use, the effect of new drugs on patients’ cells bearing specific CFTR mutations; 5) the methodology is adequate for a quantitative measurement, by fluorescence, of the CFTR gating activity of the HNECs from patients with different genotypes identifying: a) CF patients bearing two severe mutations with an activity < 10% (compared to controls – 100%); b) CF patients bearing at least a mild mutation with an activity of 10-20%; c) CF carriers (heterozygous subjects) with an activity between 40-70%.
Riassunto
La fibrosi cistica (FC) è una malattia autosomica recessiva causata da mutazioni nel gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Finora sono state descritte circa 2000 mutazioni, ma per la maggior parte di esse è difficile definirne l’effetto senza complesse procedure in vitro. Abbiamo effettuato il campionamento (mediante brushing), la cultura e l’analisi di cellule epiteliali nasali umane (HNEC) utilizzando una serie di tecniche che possono aiutare a testare l’effetto delle mutazioni CFTR. Abbiamo eseguito 50 brushing da pazienti FC e controlli, e in 45 casi si è ottenuta una coltura positiva. Utilizzando cellule in coltura: i) abbiamo dimostrato l’espressione ampiamente eterogenea del CFTR nei pazienti e nei controlli; ii) abbiamo definito l’effetto di splicing di una mutazione sul gene CFTR; iii) abbiamo valutato l’attività di gating di CFTR in pazienti portatori di differenti mutazioni; iv) abbiamo dimostrato che il butirrato migliora in modo significativo l’espressione di CFTR. I dati provenienti dal nostro studio sperimentale dimostrano che l’uso del modello ex-vivo di cellule epiteliali nasali è un importante e valido strumento di ricerca e di diagnosi nella studio della FC e può anche essere mirato alla sperimentazione ed alla verifica di nuovi farmaci. In definitiva, in base ai nostri dati è possibile esprimere le seguenti conclusioni: 1) il prelievo delle cellule epiteliali nasali mediante brushing è applicabile senza alcuna anestesia ed è ben tollerato da tutti i pazienti affetti da FC (bambini e adulti), è scarsamente invasivo e facilmente ripetibile, è anche in grado di ottenere una sufficiente quantità di HNECs rappresentative, ben conservate, idonee allo studio della funzionalità di CFTR; 2) la conservazione delle cellule prelevate è possibile fino a 48 ore prima che si provveda all’allestimento della coltura e ciò permette di avviare studi multicentrici con prelievi in ogni sede e quindi di ottenere una ampia numerosità campionaria; 3) la coltura di cellule epiteliali nasali può essere considerata un modello adatto a studiare l’effetto molecolare di nuove mutazioni del gene CFTR e/o mutazioni specifiche di pazienti “carriers” dal significato incerto; 4) il modello ex-vivo delle HNECs consente inoltre di valutare, prima dell’impiego nell’uomo, l’effetto di farmaci (potenziatori e/o correttori) sulle cellule di pazienti portatori di mutazioni specifiche di CFTR; tali farmaci possono modulare l’espressione genica del canale CFTR aprendo così nuove frontiere terapeutiche e migliori prospettive di vita per pazienti affetti da una patologia cronica come la Fibrosi Cistica; 5) la metodologia da noi istituita risulta essere idonea alla misura quantitativa, mediante fluorescenza, dell’attività di gating del canale CFTR presente nelle membrane delle cellule epiteliali nasali prelevate da pazienti portatori di differenti genotipi; in tal modo è possibile individuare: a) pazienti FC portatori di 2 mutazioni gravi con un’attività < 10% (in rapporto ai controlli -100%), b) soggetti FC portatori contemporaneamente di una mutazione grave e di una lieve con un’attività tra 10-30%, c) i cosiddetti portatori “carriers”- eterozigoti - con un’attività tra 40-70%. In conclusione la possibilità di misurare l’attività del canale CFTR in HNECs fornisce un importante contributo alla diagnosi di FC, mediante individuazione di un “cut-off diagnostico”, ed anche alla previsione della gravità fenotipica della malattia; quindi quanto rilevabile dalla misura del suddetto canale permette di prospettare per il futuro la possibilità di valutare meglio i pazienti per i quali il test del sudore ha dato risultati ambigui (borderline o negativi). La metodica da noi sperimentata consente anche di monitorare i pazienti durante il trattamento farmacologico, valutando in tal modo i reali effetti delle nuove terapie.